【出 处】：

【作 者】：

【摘 要】利用DNA同源重组方法（基因打靶）对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体,本研究以pBS246质粒为骨架,在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶（neo）基因和绿色荧光蛋白（EGFP）基因;在两个LoxP序列外侧分别插入两组携带＂8碱基＂酶切位点的多克隆位点序列（MCS-1和MCS-2）和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因,构建成通用型基因打靶载体pGT-V1,并且在C2C12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点：1）在载体中引入绿色荧光标记,可以实时监控载体的转染效率,而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证;2）在两个LoxP位点间插入绿色荧光标记,可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况,并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法,将最终去除了筛选标记的阳性细胞（即丢失绿色荧光的细胞）分选出来,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响;3）采用＂8碱基＂酶切位点的MCS序列,便于DNA大片段的连接和重组,极大提高了该载体的通用性。总之,该载体优化了基因打靶的技术手段,为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。