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【摘 要】目标基因替换是基因功能研究的重要方法，在生物工程领域广泛应用。为了提高真菌目标基因替换的效率，以稻瘟病菌为研究对象，建立了一种以gusA基因为负筛选标记的目标基因替换突变体双筛选体系（GUS—DS）。首先，检测了78个真菌菌株的内源GUS活性，发现除3个菌株外均呈阴性。同时，将gusA基因导入稻瘟病菌、镰刀病菌、炭疽病菌后，转化子可获得高的GUS活性。表明gusA可用作真菌中的筛选标记。然后，以gusA为负标记，HPH为正标记，以过氧化物酶体定位信号受体基因MGPEX5与MGPEX7的替换为例，建立稻瘟病菌GUS—DS体系。对潮霉素抗性筛选获得的转化子通过GUS活性检测进一步筛选，呈阴性者为可能突变体。通过PCR与Southern杂交对可能突变体进行验证，以此评估GUS—DS的筛选效率。结果表明GUS—DS将Amgpex5与Amgpex7的筛选效率由原来的65．8％和31．2％分别提高到90．6％和82．8％。另外，还建立了一种适合于GUS—DS的多重PCR法（M—PCR）用于突变体的验证。通过扩增目标位点的不同区段，可以有效区分突变体、野生型和随机插入转化子。M—PCR法验证突变体简便、迅速，可信度与Southern杂交相同。GUS—DS及M—PCR为功能基因组学及生物工程的研究提供了有力的工具。