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【摘 要】日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）是单股正链RNA病毒，全基因组仅含有一个开放阅读框，编码一条多聚蛋白前体，病毒编码的NS3蛋白酶在JEV多聚蛋白加工过程中起着重要作用，是重要的药物靶标。通过PCR扩增了NS2BH-NS3蛋白酶的编码区，构建了原核表达质粒并转化到大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导得到可溶性的NS3蛋白酶，用镍亲和层析方法进行了纯化。建立了基于荧光共振能量转移的NS3蛋白酶活性检测方法，并确定了最佳的反应条件，对113个化合物进行了筛选，发现其中两个化合物对JEVNS3蛋白酶具有一定的抑制活性。本研究为JEVNS3蛋白酶的活性研究及抑制剂筛选提供了一种操作方便、成本低廉的方法。